JAK2基因突变的发现改变了骨髓增殖性肿瘤的分类和诊断

从2005年报道JAK2 V617F突变发生于慢性骨髓增殖性疾病（myeloproliferative disorder，MPD）[1-3]以来，这个基因突变的发现改变了MPD的分类和诊断。以往MPD包含慢性粒细胞白血病（CML），真性红细胞增多症（PV），原发性血小板增多症（ET），和原发性骨髓纤维化（PMF）,慢性中性粒细胞白血病（CNL），慢性嗜酸细胞白血病/高嗜酸细胞综合症（CEL/HES）等多种疾病。在修订的2008 WHO分类系统中，有无JAK2突变成为MPD主要的诊断指标[4]，例如，如果JAK2突变阳性，血红蛋白增加，骨髓红系细胞明显增生可以诊断PV，即使血红蛋白低于以往WHO规定的指标值，但却持续超过正常值 20g/L的PV也可以确诊。如果JAK2突变阳性，血小板仅仅持续大于450X109/L,骨髓巨核细胞增生，可以诊断ET。中国医学科学院血液病医院血液内科李洪强

不仅MPD的诊断发生革命性进展[5]，连名称都改变了。MPD改称为骨髓增殖性肿瘤(myelo- proliferative neoplasm，MPN)，MDS/MPD(myelodysplastic /myeloproliferative disorder)称为MDS/MPN。新分类的MPN 中还包含了肥大细胞病（MCD）。而以前的慢性嗜酸细胞白血病/高嗜酸细胞综合症（CEL/HES）分别重新划分为CEL，HES和有PDGFRA, PDGFRB或者FGFR1基因异常的嗜酸细胞增高症3种MPN，并强调这类疾病的本质是肿瘤。现已明确，MPN具有共同的干细胞起源的克隆型遗传特征，临床出现不同表型是突变影响的蛋白、酪氨酸激酶及相关分子的不同构型和异常的信号转导所造成的。

2008年WHO修订MPN诊断标准的依据是多数患者都具有JAK2突变，主要是JAK2 V617F, 还有JAK2外显子12突变。由于JAK2 V617F是髓系细胞特异性的，在PV以外其他原因造成的红细胞增多症并不出现，因此是PV的一个敏感的诊断标记。髓系肿瘤中JAK2 V617F并非PV独有， 还可见于50%的ET或PMF。但其他髓系肿瘤JAK2 V617F发生频率很低，淋巴系肿瘤不出现。仅检测JAK2 V617F 突变虽然不能单独用来区分不同类别的MPN，但是结合骨髓活检的组织学依据，可以诊断ET和PMF，排除反应性的血小板增多和骨髓纤维化。

JAK2 突变在PV诊断中意义最大，我们近2年临床遇到的PV几乎都有突变，查不到突变是偶然的情况。诊断ET或PMF时则可能未发现JAK2 V617F，原因除了大约一半患者的确无突变外，还因为目前的检测方法并没有标准化[6]。应用直接测序、位点特异性PCR和荧光定量PCR检测JAK17F基因突变的方法会出现一些差异[7,8]。不同方法的检测灵敏度不同，突变检出率可能不同。通常直接测序检测的灵敏度约20-25%，位点特异性PCR方法约1-3%，荧光定量PCR方法约0.5-5%。我们的部分初诊患者血细胞携带突变的比例可低至1%，使用较高灵敏度的检测方法可提高突变的检出率。

在ET和IMF患者中突变和红细胞增多、瘙痒等类似于PV的症状相关[9]，提示突变阳性的MPD中有可能有共同的类似于PV的发病因素[10,11] 。携带纯合型还是杂合型等位基因以及突变细胞的比例都与临床症状有关，对MPD并发症的发生率及预后都有重要意义[12]。PV患者较ET或IMF患者更多携带纯合型突变细胞[13] 。临床工作对患者杂合型/纯合型突变克隆的携带情况，突变比例的定量检测也越来越重视。转染JAK2 V617F突变基因的小鼠模型可出现类似PV的表型，突变基因表达量进一步增高时可以进展为骨髓纤维化，而在突变基因低表达的小鼠模型中可以观察到一过性的血小板增多[14]。MPD疾病过程中临床症状和JAK2 V617F突变携带比例的变化很可能与杂合型突变向纯合型突变的基因转变有关[15]。

JAK2基因突变的发现也导致其他临床诊断指标的变化。PV患者血红蛋白增加或者血细胞容积增加是诊断重要的指标，但并非总是和体内红细胞总量真正增加（红细胞增多症）相一致[16]。PV有时候可以表现为红细胞压积正常，是因为血浆也相应增加了，尤其是明显脾肿大时（PV通常不明显）。既然如此，那么在经典MPN(PV, ET 和PMF)血红蛋白和血细胞容积也不一定有明显区别。过去PV专业协作组（PVSG）建议在诊断PV时使用红细胞总量 (RCM) 来克服上述缺点，然而这些建议主要基于概念而非证据，2001年的WHO标准开始强调要做骨髓活检来帮助诊断。既然几乎所有PV患者有JAK2突变，检测RCM来区分PV和继发性红细胞增多就意义不太大了，外周血JAK2V617F检测是当前PV患者首选的检查[17]。与此同时，应当鼓励检测血清Epo水平，真正的PV同时出现JAK2 V617F阴性和Epo水平正常或增加的可能性非常小，血清Epo水平检测能够发现极少见的JAK2 V617F阴性的PV。另一方面，也应该考虑检测JAK2 V617F阴性，血清EPO水平正常或者低下患者的JAK2外显子12突变和骨髓活检。骨髓细胞学变化也是ET，PMF和JAK2突变阴性的PV必须的诊断标准之一。

因为JAK2 V617F见于50% 的ET或PMF，诊断血小板增多和骨髓纤维化患者时应考虑JAK2突变。突变出现可以排除反应性骨髓增殖，然而没有检出突变并不能排除MPN的可能性。诊断ET和PMF时通常也需要骨髓检查。有时候，PV和JAK2 V617F阳性ET/PMF之间的区别不明显，如何诊治存在一定问题。我们建议严格按照2008 WHO标准作出诊断，密切监测患者，抓住任何重要的变化，确保及时修正诊断。同样，ET或PMF类似CML时也应该重视，尤其是在未发现JAK2 V617F时，在骨髓检查之初就要考虑细胞遗传学检查。如果没有发现Ph染色体，但是骨髓有小巨核细胞时，应考虑做FISH检测BCR-ABL基因。

诊断不典型MPN (CNL, HES, CEL-NOC,MCD 和不能分类的MPN)时，通常要求BCR-ABL阴性, 有红系造血异常，粒细胞发育异常，或者单核细胞发育异常（＞1x109/L）。如果外周血白细胞≥25x109/L 伴随＞80%分叶核中性粒细胞或带状中性粒细胞，不成熟粒细胞＜10%和原始粒细胞＜1%（骨髓中＜5%原始细胞）时，考虑CNL。如果发现骨髓形态学异常的肥大细胞聚集，怀疑MCD的时候，应当考虑类胰蛋白酶染色检查骨髓，做流式细胞仪分析寻找形态异常的肥大细胞 (CD25阳性), 如果有可能最好进行KIT D816V突变检测。当临床表型和经典的或者其他非经典的MPN的诊断标准不符时候，可考虑不能分类的MPN。

嗜酸细胞增多时考虑CEL-NOC或HES。CEL-NOC包含伴有嗜酸细胞增多的PDGFRA,PDGFRB 和FGFR1重排的髓系肿瘤。诊断两者都需要外周血嗜酸细胞计数≥1.5x109/L，排除继发性嗜酸细胞增多，排除其他急慢性髓系肿瘤，并且没有表型异常和/或克隆性T淋巴细胞。诊断HES需要没有细胞遗传学异常，外周血原始细胞<2%或骨髓原始细胞<5%两个条件。

基因检测在疾病诊断中愈来愈重要，从1960年在CML中发现了Ph染色体时开始， 除Ph染色体的特征性BCR-ABL基因，陆续在PV, ET和PMF中发现JAK2 V617F，PV中JAK2外显子12突变；在ET或PMF中发现的PLW515L/K，在伴有嗜酸细胞增多症的髓系恶性肿瘤中发现的PDGFRA, PDGFRB 或 FGFR1基因重排，在MCD中发现的KITD816V和其他KIT突变，在幼年型粒单细胞白血病（JMML）中的发现RAS通路突变（包括 RAS, PTPN11 或者NF1）。这些与髓系恶性肿瘤发病相关的基因的发现，最终将导致一些新分类和诊断方式。例如，检测 FIP1L1- PDGFRA突变(用FISH 或者 RT-PCR)，PDGFRB-重排(用染色体核型或 FISH)，或者FGFR1易位 (用染色体核型)都是目前原发性嗜酸细胞增多症分类及选择治疗方案的必要检查。抑制JAK2基因来治疗MPN的药物也在积极的研制中，抑制JAK2基因表达[18]的药物TG101209, Go6976, erlotinib都有临床应用的可能性。

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